Главная / Библиотека / Многофотонная микроскопия

Многофотонная микроскопия

Теги генерация второй гармоники BrightLine Микроскопия
Многофотонная микроскопия

В многофотонной микроскопии, также известной как нелинейная или двухфотонная микроскопия, образец освещается на длине волны, в два раза превышающей нормальную длину волны возбуждения. Более длинные волны имеют преимущество, потому что они более глубоко проникают в образец для получения трехмерных изображений и потому, что они не повреждают образец, что позволяет увеличить его долговечность. Для достижения многофотонного возбуждения световой луч пространственно сфокусирован (с использованием оптики), и в то же время используется высокоэнергетический короткоимпульсный возбуждающий луч, чтобы повысить вероятность того, что два (или более) фотона попадут в одно и то же место (т.е. молекула флуорофора) одновременно.

Примеры методов многофотонной микроскопии включают генерацию второй гармоники (ГВГ), генерацию третьей гармоники (ГТГ), когерентную антистоксову рамановскую спектроскопию (КАРС) и микроскопию с вынужденным излучением-истощением. Поскольку каждый из этих методов использует импульсные лазеры, важно выбирать оптические компоненты, которые минимизируют дисперсию импульсов, а отражающие лазер дихроики должны иметь низкие характеристики дисперсии групповой задержки.

ММ1

Рисунок 1. Двухцветная двухфотонная визуализация in vivo облученной коры головного мозга мыши

Как показано на рисунке 2, типичная система состоит из возбуждающего лазера, сканирующей оптики и оптики формирования изображений, чувствительного детектора (обычно фотоумножителя) и оптических фильтров для отделения флуоресценции от лазера (дихроичный светоделитель) и блокировки лазерного света. от попадания в детектор (эмиссионный фильтр).

ММ2

Рисунок 2. Типичная конфигурация многофотонного флуоресцентного микроскопа

Преимущества, предлагаемые системами многофотонной визуализации, включают истинное трехмерное изображение, возможность изображения глубоко внутри живой ткани и устранение флуоресценции вне плоскости. С помощью этого метода можно отображать флуоресцентные красители с очень короткими стоксовыми сдвигами и / или очень низкой эффективностью, и даже флуоресцентные молекулы, изначально свойственные образцу или ткани. Недостатки многофотонной визуализации включают необходимость в импульсном лазере с высокой пиковой мощностью, таком как Ti: Sapphire-лазер с синхронизацией мод, и до сих пор отсутствие высокопроизводительных оптических фильтров, обеспечивающих достаточную пропускную способность во всем диапазоне излучения и достаточная блокировка во всем диапазоне настройки лазера (рисунок 3).

ММ3

Рисунок 3. Многофотонные микроскопы требуют контроля света в очень широком спектре: от ближнего УФ до ближнего ИК

Semrock улучшил характеристики многофотонных микроскопов, представив оптические фильтры со сверхвысокой пропускной способностью, очень крутыми краями и тщательно оптимизированной блокировкой. Учитывая, сколько инвестиций обычно требуется для лазера возбуждения и других сложных элементов систем многофотонной визуализации, эти новые фильтры представляют собой простую и недорогую модернизацию для значительного повышения производительности системы.

Эмиссионные фильтры BrightLine® обеспечивают кристально чистое пропускание от ближнего УФ к ближнему ИК (рисунок 4). Фактически, излучатели выглядят так же прозрачно, как оконное стекло, в отличие от коричневатого оттенка традиционных фильтров, а длиннопроходные дихроики имеют такую широкую полосу отражения, что выглядят как зеркала с высокой отражающей способностью (рисунок 5). Эмиссионные фильтры также обеспечивают глубокую блокировку в диапазоне настройки лазера Ti: Sapphire, что имеет решающее значение для достижения высокого отношения сигнал / шум и чувствительности измерения.

ММ4

Рисунок 4. Многофотонные фильтры BrightLine обеспечивают почти идеальные характеристики, как показано на этих характерных измеренных спектрах излучателя ближнего УФ и видимого диапазонов FF01-680 / SP и дихроичного FF665-Di01

ММ5

Рисунок 5. Кристально чистые многофотонные фильтры BrightLine

Иногда желательно, чтобы ограничить спектральный диапазон флуоресцентного излучения обнаруженного в любой момент времени, особенно, когда несколько флуорофоров используются для обозначения различных целей в образце. Для этой цели идеально подходят более узкие полосовые фильтры, и Semrock предлагает широкий выбор этих полосовых фильтров, которые можно комбинировать с многофотонным излучателем практически без потери сигнала флуоресценции.

Поскольку нелинейно-оптические эффекты сильно зависят от пиковой интенсивности лазерного импульса, наиболее эффективное формирование изображения происходит, когда уширение импульса и сопровождающее его уменьшение пиковой интенсивности сведено к минимуму. Коротковолновые дихроичные светоделители BrightLine FF670-SDi01 и FF720-SDi01 предназначены для отражения возбуждающего лазерного излучения по направлению к образцу, обеспечивая при этом исключительную передачу возвращаемого сигнала флуоресценции в ближнем и видимом диапазоне или ГВГ. Дисперсия групповой задержки (ДГЗ), связанная с лазерным излучением, отраженным от этих светоделителей, очень мала. Например, ограниченный преобразованием гауссов импульс 100 фс имеет расширение менее 2% во всем диапазоне длин волн лазера для фильтра FF670-SDi01 и значительно менее 1% уширение во всем диапазоне длин волн лазера для фильтра FF720-SDi01.

ММ6

Рисунок 6. Исследования с использованием многофотонных фильтров Semrock демонстрируют силу флуоресцентных индикаторных белков Ca2 + (FCIP) для изучения динамики Ca2 + в живых клетках с помощью двухфотонной микроскопии. Трехмерные реконструкции нейрона слоя 2/3, экспрессирующего флуоресцентный белок CerTN-L15. В центре: 3 выбранных изображения (каждое снято на глубине, отмеченной соответствующими цифрами слева и справа)

 

© Semrock

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Semrock на территории РФ

Теги генерация второй гармоники BrightLine Микроскопия
Новые статьи
У Вас особенный запрос?
У Вас особенный запрос?
Весьма часто наши заказчики лучше нас знают, какое оборудование им нужно. В этом случае мы берём на себя общение с производителем, доставку и таможенную очистку, а также все вопросы гарантийного периода. Пожалуйста, заполните эту форму, и мы свяжемся с Вами, чтобы помочь решить любую Вашу задачу. Или позвоните нам по телефону +7(495)199-0-199
Форма заявки
Ваше имя: *
Ваше имя
Ваш e-mail: *
Ваш телефон: *
Ваш телефон
Наши
контакты
г. Москва, ул. Бутлерова, д. 17Б, офис 502

г. Санкт-Петербург, Коломяжский проспект, 33 корпус 2